Исследователи объединили два метода микроскопической визуализации в одном микроскопе, предоставив ученым метод с высоким разрешением отслеживания отдельных молекул в клеточном контексте. Эта разработка открывает двери для улучшения нашей способности визуализировать в мельчайших деталях то, что происходит внутри клеток.
Сегодня у ученых есть возможность заглядывать внутрь клеток с помощью невероятно мощных микроскопов. Важно, чтобы они смогли это сделать, чтобы понять, как действуют и реагируют конкретные биомолекулы. Однако у этих инструментов есть некоторые недостатки.
Возьмем, к примеру, флуоресцентную микроскопию сверхвысокого разрешения (SRM). Он отлично подходит для отслеживания отдельных молекул, например белков, в клетке, но не показывает ученым, что происходит поблизости. И хотя криогенная электронная томография (криоЭТ) дает изображения клеток с высоким разрешением, она не может точно определить, что задумали отдельные молекулы.
Итак, исследователи из Стэнфордского линейного ускорителя Министерства энергетики США Национальная ускорительная лаборатория Центра (SLAC) приступила к объединению двух методов визуализации в одном микроскопе.
«Цель состоит в том, чтобы сохранить лучшее из обоих миров», — сказал Питер Дальберг, ведущий автор исследования. «Вы сохраняете молекулярную специфичность флуоресцентной микроскопии, поэтому вы знаете, кто есть кто, а затем можете поместить это в контекст этих структур высокого разрешения из крио-ЭТ».
Флуоресцентная микроскопия предполагает маркировку отдельной молекулы меньшей молекулой, которая светится, когда на нее попадает свет. Затем молекулу можно будет отследить под обычным оптическим микроскопом, хотя и с очень высоким разрешением. Cryo-ET использует электронные микроскопы для изучения быстрозамороженных образцов, например клеток.
Объединение двух методов сразу же вызвало проблемы, которые исследователям необходимо было преодолеть. Во-первых, клетки, содержащие флуоресцентно-меченные молекулы, нужно было поместить на крио-ЭТ-сетку диаметром всего 3 мм, а затем быстро заморозить, чтобы вода на сетке превратилась в стекло (стекло). После замораживания клетка должна оставаться замороженной. Вторая проблема — размер замороженных клеток — их толщина составляет тысячи нанометров, — но электроны, используемые в криоКТ, не могут проникать глубже 200 нанометров.
Итак, исследователи разработали устройство под названием система фрезерования сфокусированным ионным лучом с прикрепленным к нему сканирующим электронным микроскопом или FIB-SEM. Сфокусированный ионный луч отсекает клеточный материал, оставляя очень тонкий слой замороженной клетки, через который может проникнуть криоЭТ. Затем сканирующий электронный микроскоп стреляет электронами в образец для получения изображений высокого разрешения.
У прототипа FIB-SEM была только одна проблема: к нему не был прикреплен оптический микроскоп, а это означало, что сетку крио-ЭТ приходилось перемещать для проведения флуоресцентной микроскопии. К счастью, это было простое решение.
«По сути, мы просто разобрали этот сложный инструмент стоимостью 1,5 миллиона долларов, чтобы установить интегрированный световой микроскоп, и теперь у нас есть гораздо лучшая система», — сказал Дальберг.
Испытывая FIB-SEM в 2020 году, отслеживая белки внутри бактериальных клеток, исследователи обнаружили, что он работает, но поняли, что материал, из которого была сделана решетка крио-ЭТ, поглощал свет и разрушал замороженные образцы. Поэтому они внесли некоторые изменения, усовершенствовав сетки и создав лучший столик для светового микроскопа.
Сейчас исследователи разрабатывают различные виды флуоресцентных меток – биосенсоров – для работы в криогенных условиях. Биосенсоры представляют собой флуоресцентные молекулы, которые меняют свои свойства излучения или возбуждения в зависимости от местной среды, светясь одним цветом в одной среде и другим цветом в другой.
«Их можно настроить на чувствительность к pH, кальцию. — Назовите это сами», — сказал Дальберг. «Существуют сотни переменных окружающей среды, на которые можно настроить. Таким образом, помимо конкретного местоположения и структурной информации с высоким разрешением, вы также можете узнать, здорова или больна моя клетка? Собираетесь пройти деление клеток? При высокой концентрации АТФ? Он предоставляет весь этот дополнительный контент».
Исследователи будут продолжать работать с FIB-SEM, пока он не будет оптимизирован и не достигнет своего полного потенциала.
